基因沉默（RNAi）及siRNA设计大全

三、构建shRNA的病毒表达载体。

常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等，机制与质粒载体相似，利用了病毒感染细胞效率比较高的特点，解决了用质粒载体转染效率低的缺陷。

siRNA寡聚核苷酸设计原则:

1. siRNA的设计是决定RNAi实验成败关键性的第一步。

并非每个siRNA都能有效引发基因沉默。和引物设计一样，设计有效的siRNA也有一些经过前人经验总结出的规则，而且这些规则随着对siRNA研究的深入也在不断完善之中。有一些开放的免费在线工具可用。付费的软件成功率比较高，3个保证中2个。

2. siRNA的反义链3'端最好以UU结尾，这被公认是最有效的的siRNA结构。

现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi，你可以尝试。不过如果是体外转录合成siRNA，要避免以G结尾，因为后继处理时RNase会切除末端的G。

3. 多个siRNA位点最好分散分布在mRNA全长上。

没有数据表明siRNA在mRNA上的前后位置和RNAi效果有什么特别的关系。如果siRNA位点因为mRNA二级结构或者蛋白结合的屏蔽而影响siRNA效果，分散分布可以减少风险。

4. 避开和其他基因同源序列，以免“误伤群众”。

潜在的目标序列都到NCBI BLAST一下，www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST，和其他基因有碱基同源的序列一定枪毙掉。

5. GC比例30%-50%比高GC含量的siRNA的成功率要高些。

有较多选择时留意，不要有连续3个以上的GC，也尽量避免出现连串的某个碱基。根据Schwards的文章，由于siRNA双链上只有一条链会结合RISC上，究竟哪条链取决于RNA解旋酶，而正义链5'端以GC开头，且5'端1－4个碱基GC含量高，且16－19位碱基GC含量低的序列，得到的siRNA反义链5'端GC含量低，3'GC含量高（也有研究表明反义链5'端前7个碱基至少有5个AU），使得反义链比较容易正确结合RISC，因而基因沉默效果比较好。

如果是shRNA表达载体，用的是RNA聚合酶III类的启动子如U6，最适合的结构是5’GN，后面连续4个U结尾即可令转录终止，要避免序列中G，减出现连续的U/A。

6. 一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNAs，平行实验以期提高成功率。

据评估，随机设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达（减少75%-95%以上的mRNA），一半以上的几率能达到50%的沉默效果。

siRNA设计工具

研究人员自建的设计工具，以及一些公开的siRNA信息数据库，仅供参考。

商家免费工具：

1. Ambion公司：http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html

2. Dharmacon公司siRNA设计:http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx

3. Dharmacon公司Seed Locator：http://www.dharmacon.com/seedlocator/default.aspx

4. Promega公司：http://www.promega.com/siRNADesigner/

5. Invitrogen公司：https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/

6. Genelink公司：http://www.genelink.com/sirna/RNAicustomorder.asp

化学合成siRNA

目前化学合成的siRNA主要有：普通siRNA、化学修饰siRNA和荧光标记siRNA。

化学修饰siRNA：可以增强siRNA在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时与普通的siRNA相比，延长了作用时间。

荧光标记siRNA：在化学合成siRNA时，可以对siRNA末端用多种荧光标记物进行标记。标记后的siRNA可用流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等观察到，确定转染效率，优化转染条件；标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。

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